細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)解答

一、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問答

1.BHK細(xì)胞就是指BHK21嗎？

    答：BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株。原始的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞。后經(jīng)無數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長，它廣泛用于增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗。zui常用的是BHK21的一個亞克隆細(xì)胞，即克隆13或C13 。

2.二倍體細(xì)胞有什么特點？

   答：二倍體細(xì)胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代50代；無致瘤性。如W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。

3.什么是動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？

    答：所謂動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、CHO（中華倉鼠卵巢）細(xì)胞、BHK-21、Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎傳代細(xì)胞）等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。

    在過去幾十年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶（roller bottle） 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器（Bioreactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。

4.細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么？

    答：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。

5.什么是無血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別？

    答：無血清培養(yǎng)基（serum free medium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。

6.什么是無血清無動物組分培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基？

    答：無血清無動物組分培養(yǎng)基是不含任何動物來源成份的無血清培養(yǎng)基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有蛋白的培養(yǎng)基，無論是植物蛋白或動物蛋白。成分培養(yǎng)基（chemical defined medium,CDM）:是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和產(chǎn)品純化。

7.HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過程中起什么作用？

    答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

8.CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

答：定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

二、 培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見問題

1.低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎？

   答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗來判定pH值，建議使用pH計進(jìn)行測定。

2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？

   答：平衡鹽一般是由無機鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM（SLM）低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。

3.谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么？

   答：以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制為例：稱取L-谷氨酰胺2.92g，加注射用水100ml，充分?jǐn)嚢杌靹颉Ｓ?.2μm濾膜正壓過濾除菌。溶液應(yīng)在4℃下避光保存，2周內(nèi)使用。以7.5% NaHCO3的配制為例：稱取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過濾除菌。

4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

   答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。酚紅本身對生物制品質(zhì)量并不會產(chǎn)生影響，可以通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。

5.放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會發(fā)生變化，為什么？

     答：培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑（通常為phenol red）的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2，以調(diào)整pH值。

6.無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

    答：當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因為血清中的蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。而在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。

7.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

    答：一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

8.什么是個性化培養(yǎng)基？它有什么優(yōu)點？

    答：根據(jù)細(xì)胞類型、培養(yǎng)方式和生產(chǎn)工藝等特點所定制的培養(yǎng)基，即個性化培養(yǎng)基。個性化培養(yǎng)基在國外生物制藥企業(yè)被普遍采用，個性化培養(yǎng)基可以為細(xì)胞生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的生長速率、培養(yǎng)密度、以及延長細(xì)胞維持時間；也可以為細(xì)胞生長提供均衡的營養(yǎng)供給，減少細(xì)胞有害代謝物質(zhì)的積累，降低對細(xì)胞生長的危害；同時對貼壁細(xì)胞而言，能增加細(xì)胞的貼壁性，并降低培養(yǎng)過程中剪切力對細(xì)胞的損傷；個性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶的特殊需求減少或不使用動物源成分，從而使生物制品安全性更有保障。

9.細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

    答：如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

10.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

    答：動物細(xì)胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95%原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

11.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？

    答：大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)過多會將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀，這將會影響它的性能。

12.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？

    答：要冷藏?。⊥ǔＲ后w培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個月到一年。

三、常見血清使用問題
1.血清使用時一定需要滅活么？

答：實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量。

2.何謂FBS, FCS, CS, HS?

答：FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。

3.保存血清的方法是什么?

答：我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

4.如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

答：將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

5.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

    答：血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。

6.如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

    答: （1）解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如-20℃至37℃），非常容易產(chǎn)生沉淀物。

        （2）解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

        （3）請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

        （4）血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

        （5）若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

四、細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑使用問答

1.谷氨酰胺使用方法是什么？

    答：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

2.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定？

答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細(xì)微結(jié)晶。比重2.159。無臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性，受熱易分解，在65℃以上迅速分解，在270℃時*失去二氧化碳，在干燥空氣中無變化，在潮濕空氣中緩慢分解。

3.培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？

    答：可能得原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗找出可能的原因。

        解決辦法：增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度；讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補加谷氨酰胺或生長因子等；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存；含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內(nèi)用完；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。

4.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

    答：L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時非常重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

5.細(xì)胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？

    答：不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力zui強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：

     （1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；

     （2）0.25% 胰蛋白酶

     多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。

6.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

    答：二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

7.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

    答：GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

    答：丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank′s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle′s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？

    答：HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagle′s （2.2g/L）中比在Hanks′ （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagle′s液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks′液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagle′s液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks′液就可以了。

五、細(xì)胞培養(yǎng)過程常見問題

1.為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時傳代？

    答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細(xì)胞的生長得以繼續(xù)。

2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？

    答：通常細(xì)胞生長得非?？鞎r，pH值通常下降得很快。此時可以及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。

       （1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5％到10％。

       （2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液。

       （3）松開瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。

       （4）在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

       （5）如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。

3.培養(yǎng)液pH對細(xì)胞生長的影響？

    答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細(xì)胞生長將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對pH變動耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強。但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強一些。在配制培養(yǎng)用液時，需要注意一點：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。

4.購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？

    答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對于DMSO敏感的細(xì)胞，還是復(fù)蘇細(xì)胞時，用離心去除DMSO比較好。

5.購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

    答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細(xì)胞置于–80 ℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。

6.支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

    答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

7.冷凍保存細(xì)胞之方法？

    答：冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃（30－60 分鐘）→-20℃（ 30 分鐘） → -80℃（16－18 小時或隔夜）→ 液氮罐長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下， 再放入液氮中長期儲存。注意：-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

8.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

    答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

9.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

    答：欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300×g （約1,000rpm），5 - 10 分鐘，過高之轉(zhuǎn)速過長時間都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對離心決定。 RCF=1.119×105×r×（rpm）2，其中 r為離心機轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部內(nèi)壁的距離；rpm為離心機每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF（relative eentrifugal force）為相對離心力，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍數(shù)來表示表示單位。

10.培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？

    答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

11.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

    答：除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。

12.冷凍管應(yīng)如何解凍？

    答：取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細(xì)胞，用75％消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

13.如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞？

    答：將樣品適當(dāng)稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4％的臺盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點樣到血球計數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞，因活細(xì)胞排斥臺盼蘭，不被染色。

14.細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

    答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial。

15.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

    答：動物細(xì)胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

16.如何消除組織培養(yǎng)的污染？

    答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3）每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。

5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6）重復(fù)步驟4。

7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除。

17.培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)死亡其可能的原因有什么？解決辦法有哪些？

    答：可能的原因有培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2；培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大；細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確；培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積等。解決辦法可以檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；取新的保存細(xì)胞種；檢測培養(yǎng)液滲透壓等；換入新鮮培養(yǎng)液等。

18.國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？

答：可以從國內(nèi)多家代理廠家買到ATCC或ECACC的細(xì)胞株，同時國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方還有中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，中國科學(xué)院細(xì)胞研究所以及武漢大學(xué)冷藏中心等。

19.細(xì)胞的滲透壓耐受性是多少？

    答：細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

20.支原體（mycoplasma） 污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

    答：不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。

21.怎樣查到一個特定細(xì)胞株的相關(guān)知識和培養(yǎng)條件？

    答：ATCC （American Type Culture Collection） 收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。

22.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

    答：胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。